TransAM® Flexi NFκBキット

ELISAをベースとしたp50, p52, p65, c-RelおよびRelBのDNA結合活性測定

TransAM Flexi NFκB FamilyTransAM Flexi NFκB Family Kit
TransAM Flexi NFkBTransAM Flexi NFκB p50 / p65 Kits
   

TransAM® Flexi NF-κBキットは、ポジティブコントロール用の細胞抽出物とビオチン化オリゴDNAの他、NF-κBの実験に必要な構成品一式を提供します。TransAM® Flexi NF-κBキットは、研究者自身が独自設計したNF-κBの結合配列を調べることが可能です。本キットは、活性型NF-κBを捕捉するために、まず、使用者が設計したビオチン化オリゴDNAと刺激後の核抽出物を混合して反応させ、反応液をストレプトアビジンコートされた96 strip wellプレートに移すことにより、活性型NF-κBを検出します。各キットには活性型のp50またはp65に特異的な抗体が付属します。ファミリーキットにはNF-κB ファミリー(p50、p52、p65、c-RelおよびRelB)をスクリーニングするための抗体が含まれます。また、TransAM® NF-κB転写因子ELISAキットをご利用時に、オプションのタンパク質標準品として利用可能なp50およびp65のリコンビナントタンパク質も別途ご用意しています。当ページの下部にあるTransAM® Flexiのタブを開くとTransAMの原理に関する詳細をご覧いただけます。また、キットのマニュアルは資料のタブを開くとダウンロードできます。

TransAM NFkB Flexi data

異なる結合配列に対するNF-κB p65の測定
未処理およびTNF-α処理をしたHeLa細胞の核抽出物5 μgを用いて、4種類の異なるビオチン化オリゴDNA (50 mer) とNF-κB p65との結合能を調べた。 試験に用いた3種のオリゴDNA( Igκ、IL-8、uPA)はそれぞれ、NF-κBにより調節される各遺伝子プロモーターの野生型結合配列を含んでいる。これらの結合配列との結合をTransAM Flexi NF-κBキットにコントロールとして含まれるコンセンサス結合配列と比較した。

 

* Technology covered under EAT-filed patents and licensed to Active Motif. Use of TransAM in NFκB-related drug discovery may be covered under U.S. Patent No. 6,150,090 and require a license from Ariad Pharmaceuticals (Cambridge, MA, USA).

 

 
Name Format Cat No. Price  
TransAM® Flexi NFκB Family 2 x 96 rxns 43298 ¥260,000 Buy
TransAM® Flexi NFκB p50 1 x 96 rxns 41098 ¥140,000 Buy
TransAM® Flexi NFκB p65 1 x 96 rxns 40098 ¥140,000 Buy

TransAM® Flexi NFκB転写因子活性測定ELISAの利点

転写因子研究は歴史的にEMSA/ゲルシフトアッセイやウェスタンブロット、レポータープラスミドのトランスフェクションを用いて行われてきました。しかしいずれの方法も、多大な時間を要してハイスループット実験に不向きなことに加え、半定量的な結果しか得られませんでした。TransAM®アッセイはゲルシフトアッセイに比べて最大で100倍以上も感度が高く、5時間以内で終えることが可能です。TransAM®は、ELISAを基にした手法*であるため、ラジオアイソトープが不要なうえ、strip wellの採用により1~96サンプルを幅広いスループットでスクリーニング可能です。さらに、レポータープラスミドのトランスフェクションによる発現のばらつきを回避するために行われる安定発現細胞株の作製からも解放されます。

なぜTransAM® Flexi転写因子活性測定を用いるのか?

  • ゲルシフトアッセイよりも最大で100倍高感
  • ラジオアイソトープや電気泳動が不要
  • 5時間以内に結果を取得可能
  • 化学発光のためルミノメーターやCCDカメラを用いて簡便かつ定量的に測定可能
  • 96 strip wellにより幅広いスループットに対応

TransAM® Flexiの利用可能な用途

  • 転写因子の結合配列バリアントの研究
  • ネイティブプロモーターの解析
  • クロマチン免疫沈降(ChIP)の結果の検証
  • NF-κBに対するアイソフォーム結合親和性の決定

TransAM® Flexi転写因子ELISAキットの概要

TransAM® Flexiキットは、転写因子のコンセンサス配列を代替する、新規結合配列の探索に関心のある研究者に最適な実験手法です。TransAM Flexiキットでは、研究者自身に転写因子の結合配列を含むビオチン化オリゴDNA (またはPCR産物)をご用意いただきます。まず、このビオチン化オリゴDNAと刺激した細胞由来の核抽出物を混合し、ストレプトアビジンがコートされた96 strip wellプレートに移します。これにより、ビオチン化オリゴDNAと活性化転写因子からなる複合体が捕捉されます。次に、標的DNAに結合した活性型転写因子に特異的な一次抗体を加えてインキュベーションした後、HRP標識二次抗体および発色試薬を順次反応させることにより、簡便かつ高感度な比色定量を可能とします(図1)。

TransAM Flexi flow chart
図1:TransAM Flexiの作業手順

 

* Technology covered under EAT-filed patents and licensed to Active Motif. Use of TransAM in NFκB-related drug discovery may be covered under U.S. Patent No. 6,150,090 and require a license from Ariad Pharmaceuticals (Cambridge, MA, USA).

構成品と保存条件

TransAM Flexiキットは、NF-κBのコンセンサス配列を代替する、新規結合配列の探索に関心のある研究者向けに設計されているため、研究者ご自身に、関心のある結合候補オリゴDNAをご準備のうえ、プレートにコーティングしていただだきます。 本キットでは、TransAM NF-κB キットに同梱されるNF-κBコンセンサス配列を含んだポジティブコントロールオリゴDNAと同等のビオチン化オリゴDNAが40回分提供されます。もし、NF-κBのコンセンサス配列のみを対象とされる場合は、オリジナルのTransAM NF-κBキットをご利用ください。Flexiキットにはストレプトアビジンがコートされた1または2枚の96 strip wellプレート(シール付き) 、各NF-κBサブユニット(p50またはp65)に対する一次抗体、または、p50、052、p65、c-RelおよびRelBに対する一次抗体セット(TransAM® Flexi NFκB Familyキット)、HRP標識二次抗体、野生型および変異型NF-κBのコンセンサス配列を含むオリゴDNA、ポジティブコントロール細胞抽出物、DTT、プロテアーゼ阻害剤カクテル、ニシン精子DNA、Lysis Buffer、Binding Buffer、10X Washing Buffer、10X Antibody Binding Buffer、Developing Solution、Stop Solutionが含まれます。試薬類の保存条件は-80℃から室温まで様々ですので詳細はマニュアルをご参照ください。すべての試薬類は適切に保管された場合、6か月間安定であることを保証します。

注意:p50およびp52の抗体は、ヒトおよびマウスのサンプルに使用可能ですが、p65およびRelBの抗体はヒト、マウスに加え、ラットのサンプルにも使用できます。c-Relの抗体はヒト由来のサンプルにのみ使用可能です。


* Technology covered under EAT-filed patents and licensed to Active Motif. Use of TransAM in NFκB-related drug discovery may be covered under U.S. Patent No. 6,150,090 and require a license from Ariad Pharmaceuticals (Cambridge, MA, USA).


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